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1. 取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻

2. 吸出细胞悬液,并加10倍以上培养液

3. 1000r/分钟离心5分钟，去除上清

4. 用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入37℃ CO2培养箱静置培养

5. 镜检细胞贴壁能力，次日更换一次培养液,继续培养

培养方法：

收到细胞后，在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：

如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，留10ml培养液继续培养。

如果细胞已长满（达80-90%）。即可进行传代，具体步骤如下：

a，弃去培养液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶内加入1.0-2.0ml酶液，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培养液，轻轻吹打细胞。

c，加入等量的的培养液，轻轻吹打混匀后吸出一半，分到新的培养

d，传代比例：1:2-1:3
保存和应用：

客户可以根据自己的需求选择新鲜或者冻存的原代细胞，如是新鲜原代细胞，客户收到细胞后应立即将其放入CO2细胞培养箱内静置后2-3h，再进行后续的实验操作。如是冻存细胞，客户收到细胞后应立即将其放入液氮、-80℃冰箱或立即进行复苏。

细胞复苏的原则：

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

1）该细胞只能用于科研，不得用于临床。

2）收到细胞后先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

3）仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

4）用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。

5）请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议直接购买我司提供的培养基。

6）建议客户收到细胞后qian3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。
细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例；

a、收集细胞，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

 友情提示注意以下几点：

1、收到细胞后请尽快更换为含15%血清的新鲜培养基，如因特殊情况需要继续使用原瓶，请在原瓶培养基中额外添加10%的血清

2、贴壁细胞收到当天切忌立刻消化，请将细胞换液后放置培养箱孵育到第二天再做消化传代，请优先选择直径6cm的培养皿进行传代培养

3、如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时做好照片记录并联系实验室